Тест-система Veratox Гентамицин

Гентамицин представляет собой растворимый в воде аминогликозидный антибиотик. Антибактериальное действие гентамицина определяется возможностью его необратимого связывания с субъединицей 30S бактериальной рибосомы, за счет чего блокируется синтез белков. Данное вещество считается полезным для лечения серьезных инфекционных заболеваний, вызванных грамотрицательными микроорганизмами. Все аминогликозиды обладают потенциальной токсичностью, вызывая значимые расстройства слуха и вестибулярного аппарата у людей и животных. Тем не менее, они используются в медицинской практике из-за своего антимикробного и антигрибкового действия.

ЭКСТРАКЦИЯ ОБРАЗЦОВ

1. Мышцы

2. Удалите жир из образца. Проведите гомогенизацию образца подходящим миксером.

3. К 1 г гомогенизированного образца добавьте 4 мл 1X буфера для экстракции гентамицина A.

4. Выдержите образец на вортексе 1 минуту.

5. Выдерживайте образец 10 минут при 40°C.

6. Выдержите образец на вортексе еще 5 минут.

7. Охладите образец  на льду или при 4°C в течение 10 минут, а затем проведите центрифугирование в течение 5 минут при 4,000 x g.

8. Перенесите 200 мкл прозрачного супернатанта (надосадочного раствора) в новую пробирку, содержащую 20 мкл 1X буфера для уравновешивания гентамицина. Осторожно перемешайте образец.

9. Добавьте 180 мкл 1X буфера для экстракции образца. Выдержите на вортексе в течение 2 минут.

10. Используйте 50 мкл на одну лунку для анализа.

УЧТИТЕ: Коэффициент разбавления: 10.

МЕТОДИКА АНАЛИЗА

1. Добавьте по 50 мкл каждого стандартного раствора гентамицина в разные лунки с дублированием (каждый стандарт – 2 лунки).

УЧТИТЕ: Добавляйте стандарты на планшет в порядке повышения концентрации (белый, желтый, оранжевый, розовый, фиолетовый и синий).

2. Добавьте по 50 мкл каждого образца в разные лунки с дублированием (каждый образец – 2 лунки).

3. Добавьте 100 мкл антитела #1 и перемешайте путем движения микропланшета вперед-назад по плоской поверхности в течение 1 минуты.

4. Взращивайте планшет 30 минут при комнатной температуре (20–25ºC/68–77ºF).

5. Вытряхните содержимое лунок в емкость для отходов. Промойте каждую лунку 250 мкл 1X промывочного раствора и вытряхните содержимое. Повторите операцию промывки 3 раза. После последней промывки переверните микропланшет и осторожно вытряхните все остатки жидкости, осторожно постукивая им по бумажному полотенцу.

УЧТИТЕ: Проведите следующий этап немедленно (в течение 1 минуты) после промывки микропланшета. Не допускайте пересыхания микропланшета высохнуть на воздухе между этапами.

6. Добавьте 150 мкл раствора 1X антитело #2. Инкубируйте микропланшет 30 минут при комнатной температуре (20–25ºC / 68–77ºF).

УЧТИТЕ: Избегайте прямых солнечных лучей и холодных лабораторных столов во время инкубации. Рекомендуется накрыть микропланшет во время инкубации.

7. Вытряхните содержимое лунок в емкость для отходов. Промойте каждую лунку 250 мкл 1X промывочного раствора и вытряхните содержимое. Повторите операцию промывки 3 раза. После последней промывки переверните микропланшет и осторожно вытряхните все остатки жидкости, осторожно постукивая им по бумажному полотенцу.

УЧТИТЕ: Проведите следующий этап немедленно (в течение 1 минуты) после промывки микропланшета. Не допускайте пересыхания микропланшета высохнуть на воздухе между этапами.

8. Добавьте 100 мкл субстрата TMB в каждую лунку. Инкубируйте микропланшет в течение 15 минут при комнатной температуре (20–25ºC / 68–77ºF) в темноте. Засеките время реакции сразу после добавления субстрата. В ходе инкубации перемешайте путем движения микропланшета вперед-назад по плоской поверхности в течение 1 минуты.

УЧТИТЕ: Не сливайте любые количества субстрата обратно в оригинальную емкость для предотвращения его потенциального загрязнения. Рекомендуется накрыть микропланшет во время инкубации.

9. После инкубации добавьте 100 мкл стоп-буфера для остановки ферментативной реакции.

10. Считайте микропланшет как только это станет возможным после добавления стоп-буфера на считывателе микропланшетов с длиной волны 450 нм.

УЧТИТЕ: Перед считыванием протрите дно микропланшета безворсовой салфеткой для удаления любой влаги или отпечатков пальцев, которые могут повлиять на измерение.

• Более точное определение гентамицина