Тест-система Veratox Сульфаниламид

Сульфаниламиды представляют собой класс антибиотиков, используемых в кормах и в воде для лечения кишечных инфекций и других болезней у животных, используемых для приготовления пищевой продукции. Остатки сульфаниламида могут встречаться в пищевых продуктах животной природы. Максимальное содержание остатков всех веществ класса сульфаниламидов составляет 100 ppb для мускулов, жира, печени и почек.

ЭКСТРАКЦИЯ ОБРАЗЦОВ

1. Проведите гомогенизацию 10 г тканей подходящим миксером.

2. Взвесьте 1 г (± 0.05 г) образца в 15 мл пластиковой конической пробирке. Соберите весь образец на дне пробирки.

3. Взращивайте образец 15 минут при 37°C.

УЧТИТЕ: При проведении экспериментов по извлечению анализируемого вещества добавьте целевую концентрацию вещества в каждую пробирку и после этого проводите взращивание образца.

4. Добавьте точно 2.5 мл ацетонитрила и 0.5 мл деионизированной воды к каждому образцу.

УЧТИТЕ: Герметично закройте крышки, чтобы на стадии вортекса не произошло потери растворителя.

5. Проведите тщательное перемешивание образца на вортексе в течении 30 секунд. Во время перемешивания наклоняйте трубки, чтобы усиленно перемешивать смесь. Подождите, пока образец осядет на дно пробирки.

6. Медленно откройте все крышки, чтобы вышел любой скопившийся под ними газ. Герметично закройте крышки. Проведите центрифугирование образцов в течение 10 минут при 4 000 x g и комнатной температуре (20–25°C / 68–77°F).

7. Медленно перенесите 1 мл супернатанта (надосадочной жидкости) в новую 15 мл пробирку с 0,5 мл 1X буфера для экстракции почек.

8. Добавьте 2.5 мл этилацетата стеклянной пипеткой. Перемешайте все образцы вручную или с помощью многопробирочного вортекса в течение 5 минут.

9. Медленно откройте все крышки, чтобы вышел любой скопившийся под ними газ. Герметично закройте крышки. Проведите центрифугирование образцов в течение 10 минут при 4 000 x g и комнатной температуре (20–25°C / 68–77°F).

10. Медленно перенесите 0.5 мл верхнего слоя в новую 15 мл пластиковую коническую пробирку.

11. С помощью аппарата продувки под аргоном с 60°C водной бани выпарите растворитель, сконцентрировав образец в сухом остатке.

12. К данному остатку медленно добавьте точно 1,0 мл 1X Буфера A для экстракции сульфаниламида.

УЧТИТЕ: Для каждого образца используйте новый наконечник пипетки.

13. Герметично закройте крышки. Быстро поскребите днищами пробирок вперед назад по подставке для микроцентрифужных пробирок в течение не менее 10 минут для разрушения таблетки и помощи в ее растворении. Учтите: раствор должен стать белым и пенным, в зависимости от сил, приложенных для выполнения данного этапа.

14. Поместите образцы на вортекс на 1 минуту.

15. Проведите ультразвуковую обработку образца в течение 1 минуты при 37°C в водяной бане.

УЧТИТЕ: Постучите пробирку по краю или дну ультразвуковой бани при обработке. Убедитесь, что твердые частицы не находятся на боках пробирки.

16. Поместите образцы на вортекс еще на 1 минуту, после этого выдержите образцы при комнатной температуре (20–25°C / 68–77°F) 10 минут перед следующим этапом.

УЧТИТЕ: Если после выдерживания раствора в нем присутствуют твердые частицы, то повторите действия с 13 этапа. Из-за природы некоторых образцов и тщательности проведения экстракции может понадобиться более длительное время на растворение сухого остатка в конечной суспензии. Если остаток растворился не полностью, то это приведет к неточным и невоспроизводимым результатам на стадии иммуноферментного анализа ELISA.

17. Поместите каждый образец на вортекс на 15 секунд перед переносом 50 мкл на каждую лунку для проведения иммуноферментного анализа ELISA.

УЧТИТЕ: Коэффициент разбавления.

МЕТОДИКА АНАЛИЗА

1. Добавьте по 50 мкл каждого стандартного раствора сульфаниламида в разные лунки с дублированием (каждый стандарт – 2 лунки).

УЧТИТЕ: Добавляйте стандарты на планшет в порядке повышения концентрации (белый, желтый, оранжевый, розовый, фиолетовый и синий).

2. Добавьте по 50 мкл каждого образца в разные лунки с дублированием (каждый образец – 2 лунки).

3. Добавьте 100 мкл антитела к сульфаниламиду  #1 и перемешайте путем движения микропланшета вперед-назад по плоской поверхности в течение 1 минуты.

УЧТИТЕ: прижимайте подушечки пальцев к плоской поверхности.

4. Взращивайте планшет 30 минут при комнатной температуре (20–25ºC/68–77ºF).

УЧТИТЕ: Накройте микропланшет и поместите его в темное место.

5. Вытряхните содержимое лунок в емкость для отходов. Промойте каждую лунку 250 мкл 1X промывочного раствора и вытряхните содержимое. Повторите операцию промывки 3 раза. После последней промывки переверните микропланшет и осторожно вытряхните все остатки жидкости, осторожно постукивая им по бумажному полотенцу.

УЧТИТЕ: После добавления промывочного буфера в лунки выдержите микропланшет при комнатной температуре (20–25°C / 68–77°F) 20 для уравновешивания буфера.

6. Добавьте 150 мкл свежеприготовленного раствора 1X антитела, связанного с пероксидазой хрена # 2 в каждую лунку. Перемешайте путем движения микропланшета вперед-назад по плоской поверхности в течение 1 минуты. Взращивайте микропланшет 30 минут при комнатной температуре (20–25ºC / 68–77ºF) в темноте.

7. Вытряхните содержимое лунок в емкость для отходов. Промойте каждую лунку 250 мкл 1X промывочного раствора и вытряхните содержимое. Повторите операцию промывки 3 раза. После последней промывки переверните микропланшет и осторожно вытряхните все остатки жидкости, осторожно постукивая им по бумажному полотенцу.

8. Добавьте 100 мкл субстрата TMB в каждую лунку. Взращивайте микропланшет в течение 15 минут при комнатной температуре (20–25ºC / 68–77ºF) в темноте. Перемешайте путем движения микропланшета вперед-назад по плоской поверхности в течение 1 минуты. Засеките время реакции 15 минут сразу после добавления субстрата. Общее время выдерживания с субстратом TMB составляет 15 минут.

УЧТИТЕ: Не сливайте любые количества субстрата обратно в оригинальную емкость для предотвращения его потенциального загрязнения. Любой раствор субстрата, в котором заметно окрашивание, должен быть утилизирован, так как окрашивание является признаком его непригодности. Рекомендуется накрыть микропланшет во время взращивания.

9. После взращивания добавьте 100 мкл стоп-буфера для остановки ферментативной реакции.

10. Считайте микропланшет как только это станет возможным после добавления стоп-буфера на считывателе микропланшетов с длиной волны 450 нм.

УЧТИТЕ: Перед считыванием протрите дно микропланшета безворсовой салфеткой для удаления любой влаги или отпечатков пальцев, которые могут повлиять на измерение.

• Более точное определение сульфаниламида

Хранение: 2–8°C

Содержимое набора:

Покрытый cульфаниламидом-Ab-планшет 1 x 96-планшет (8 микролунок x 12 полосок

Стандарты SMX:

0 нг/мл (пробирка с белой крышкой) 0.8 мл

0.50 нг/мл (пробирка с желтой крышкой) 0.8 мл

1.5 нг/мл (пробирка с оранжевой крышкой) 0.8 мл

5.0 нг/мл (пробирка с розовой крышкой) 0.8 мл

15.0 нг/мл (пробирка с фиолетовой крышкой) 0.8 мл

50.0 нг/мл (пробирка с синей крышкой)  0.8 мл

1000 нг/мл (пробирка с красной крышкой)

Антитело к сульфаниламиду #1, 12 мл

100X антитело, связанное с пероксидазой хрена #2, 250 мкл

Антитело к сульфаниламиду #2 разбавитель, 20 мл

10X Буфер A для экстракции сульфаниламида, 25 мл

20X Промывочный раствор**, 28 мл

Стоп-буфер**, 14 мл

Субстрат TMB**, 12 мл

3X Буфер для экстракции почек, 20 мл

10X Буфер E для экстракции образца, 25 мл

Концентрированный буфер для экстракции из тканей, 62 г